Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Hoàng Ngân
Sự cần thiết:
Xơ vữa động mạch ngày càng trở nên phổ biến do các vấn đề về lối sống như ít vận động và ăn thức ăn không tốt. Xơ vữa động mạch đã trở thành nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới. Đó là một tình trạng dần dần bắt đầu từ khi còn trẻ. Nguyên nhân chính xác của bệnh này vẫn chưa được biết rõ, nhưng nhiều yếu tố được chỉ ra là góp phần hình thành các mảng xơ vữa động mạch. Xơ vữa động mạch là tổng hợp các hiện tượng thay đổi cấu trúc nội mạc của các động mạch lớn và trung bình, bao gồm sự tích tụ cục bộ của lipid, phức hợp glucid, máu và các sản phẩm của máu, mô xơ và lắng đọng axit, làm thay đổi môi trường động mạch. Ở các nước công nghiệp phát triển có tới 50% số ca tử vong do bệnh tim mạch, trong đó nguyên nhân do xơ vữa động mạch chiếm 50%. Tại Hoa Kỳ, có tới 88% người lớn trên 60 tuổi bị xơ vữa động mạch và bệnh này phổ biến ở người trên 80 tuổi. Tại Việt Nam, chưa có số liệu cho toàn bộ dân số; tuy nhiên, tỷ lệ người mắc các vấn đề tim mạch liên quan đến xơ vữa ngày càng gia tăng và độ tuổi khởi phát trung bình ngày càng giảm.

Xơ vữa động mạch có thể xảy ra ở nhiều thực thể mạch máu như động mạch cảnh, động mạch vành, động mạch chi dưới,… và nó có thể dẫn đến nhiều loại bệnh liên quan. Khi các mảng xơ vữa động mạch bị vỡ, chúng tạo ra các cục máu đông lấp đầy mạch - vốn đã bị thu hẹp bởi các mảng xơ vữa. Những mảng này hầu như luôn đóng vai trò chính trong các biến cố tim mạch: nhồi máu cơ tim, nhồi máu não, tắc mạch chi... Nguy cơ các yếu tố gây xơ vữa động mạch bao gồm các yếu tố nguy cơ truyền thống như rối loạn lipid máu hoặc cholesterol xấu cao trong máu, là những yếu tố nguy cơ chính của xơ vữa động mạch. Các yếu tố nguy cơ khác bao gồm tăng huyết áp, hút thuốc lá, tiểu đường, béo phì, ít vận động, căng thẳng và dùng thuốc tránh thai.

Xu hướng điều trị hiện nay là sử dụng các hoạt chất chiết xuất từ nguồn thảo dược thiên nhiên để bổ sung, thay thế các loại thuốc tổng hợp vì tính hiệu quả và hạn chế tác dụng phụ. Cây thuốc ngày nay vẫn được sử dụng phổ biến, bất chấp những tiến bộ của y học hiện đại, là nguồn gốc của nhiều loại thuốc và thực phẩm chức năng. Ở Việt Nam, cây thuốc tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh tim mạch, bao gồm xơ vữa động mạch. Trong số các loại dược liệu quan trọng, tỏi đen, bụp giấm, giảo cổ lam và trạch tả có những thành phần hóa học có tác dụng hạ cholesterol máu, hạ glucose máu, dự phòng và điều trị xơ vữa động mạch theo các cơ chế, vị trí tác dụng khác nhau, khi phối hợp với nhau thường tạo ra được tác dụng hiệp đồng. Trạch tả có tác dụng lợi niệu, thải muối, có lợi trong dự phòng và điều trị xơ vữa động mạch khi phối hợp với các dược liệu có tác dụng hạ cholesterol máu, hạ glucose máu. Tuy nhiên việc sử dụng các dược liệu này vẫn chủ yếu là theo phương pháp truyền thống, làm tác dụng của các dược liệu không cao, không thuận tiện cho người bệnh. Do vậy việc kết hợp y học cổ truyền và y học hiện đại, chuyển dạng từ các dược liệu thành các dạng bào chế hiện đại, làm tăng tác dụng và thuận tiện cho sử dụng của người bệnh là việc làm cần thiết.

Mục tiêu:
- Bào chế được cao định chuẩn của tỏi đen, bụp giấm, trạch tả và giảo cổ lam.
- Bào chế được viên nang cứng từ các cao định chuẩn trên.
- Đánh giá độc tính, tác dụng dự phòng và điều trị xơ vữa động mạch của viên nang trên thực nghiệm.
 

Kết quả của đề tài:
1. Đã bào chế được cao định chuẩn của tỏi đen, bụp giấm, trạch tả và giảo cổ lam.
Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn dược liệu bụp giấm, gồm:
1.1.1. Đã xây dựng được phương pháp định lượng acid protocatechuic trong dịch chiết bụp giấm bằng phương pháp HPLC với các thông số được lựa chọn như sau: Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm); Detector: PDA; Nhiệt độ cột: 30oC; Thể tích tiêm: 10 µl; Bước sóng định lượng: 260 nm; Hệ dung môi: A - Acid trifluoroacetic (0,1%), B – ACN; Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút; và điều kiện gradient của pha động theo bảng sau:

Đã tiến hành thẩm định phương pháp định lượng  trên các chỉ tiêu: tính tương thích của hệ thống; tính đặc hiệu, chọn lọc; độ tuyến tính; độ đúng; độ lặp lại.

1.1.2. Đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu đài hoa bụp giấm làm nguyên liệu đầu vào như sau:
+ Mô tả: Đài nhăn nheo, dài 2-3 cm, gồm 5 thùy hợp với nhau ở phần dưới, có đài con đính kèm. Bên ngoài màu đỏ mận, hơi đen, bên trong màu nhạt hơn. Phía trong có nhiều lông con. Vị rất chua.
+ Soi bột: Bột có màu đỏ mận, vị rất chua, mùi thơm. Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy: mảnh mô mềm, mạch mạng, mạch xoắn. Mảnh mô mềm chứa các tinh thể calci oxalat.
+ Độ ẩm: Không quá 5,0 %.
+ Định tính: Dương tính với các phản ứng của flavonoid (03 phép thử trên).
+ Định lượng: Hàm lượng acid protocatechuic không được nhỏ hơn 100,00 µg/g (so với dược liệu khô tuyệt đối).
+ Tỉ lệ vụn nát: Không quá 5%.
+ Tro toàn phần: Không quá 10%.

1.2. Đã xây dựng được quy trình chiết xuất bào chế các cao định chuẩn
1.2.1. Quy trình chiết xuất, bào chế cao định chuẩn bụp giấm
- Phương pháp chiết siêu âm gia nhiệt với dung môi là ethanol 30%, tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/12, ở nhiệt độ 700C, thời gian 30 phút/lần, chiết 01 lần. Cô dịch chiết thu được ở nhiệt độ 60 -700C, cao lỏng bụp giấm (1:3) thu được để lắng qua đêm sau đó gạn. Thu phần cao lỏng, phần cắn hoà tan thêm EtOH 30% theo tỷ lệ 1:1, để lắng qua đêm, gạn thu phần dịch, làm như vậy 2 lần nữa. Phần dịch thu được của 3 lần đem gộp với phần cao lỏng ở trên thu được cao lỏng 1:3.
- Đã lựa chọn được quy trình bào chế bột cao Bụp giấm từ cao lỏng 1:3; sử dụng tá dược độn là hỗn hợp Aerosil : Maltodextrin (60:40); với tỷ lệ tá dược/ chất rắn là 0,3; Tỷ lệ chất rắn trong dịch phun: 12%; nhiệt độ đầu vào là 1300C; nhiệt độ đầu ra: 102-1050C; tốc độ cấp dịch là 30 ml/phút.
- Đã thẩm định đánh giá độ ổn định của quy trình trên 3 mẻ 5kg dược liệu/mẻ
- Đã tiến hành đánh giá và đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của bột cao khô bụp giấm gồm các chỉ tiêu:
+ Tính chất: Bột khô tơi, màu đỏ mận chín, không có nấm mốc, mùi thơm, vị chua, dễ bị hút ẩm khi để ngoài không khí.
+ Độ ẩm: Không quá 5,0%.
+ Độ mịn: Lượng bột qua rây số 355 không được dưới 95,0%.
+ Kim loại nặng: Không quá 10 ppm.
+ Định tính: Phải có phép thử định tính của bụp giấm.
+ Định lượng: Hàm lượng acid protocatechuic không nhỏ hơn 300 µg/g tính theo chế phẩm khô kiệt.
+ Độ nhiễm khuẩn: Tổng số vi sinh vật hiếu khí không quá 104 CFU/g; tổng số nấm không quá 102 CFU/g; Không quá 102 CFU vi khuẩn Gram âm dung nạp mật trong 1 g. Không có Salmonella trong 10 g. Không có Escherichia coli, Staphylococcus aureus trong 1 g..

1.2.2. Quy trình chiết xuất, bào chế cao định chuẩn tỏi đen
- Phương pháp chiết siêu âm gia nhiệt với dung môi là nước tinh khiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/10, ở nhiệt độ 500C, thời gian 70 phút/lần, chiết 02 lần.
- Đã xây dựng điều kiện điều chế bột cao khô tỏi đen: dịch chiết được cô về cao lỏng có hàm ẩm khoảng 25 %, tá dược phối hợp là tinh bột, tỷ lệ phối hợp là 20 % so với lượng chất rắn có trong cao, sấy khô ở nhiệt độ sấy 900C trong 13 giờ.
- Đã thẩm định đánh giá độ ổn định của quy trình trên 3 mẻ 5kg dược liệu/mẻ
- Đã tiến hành đánh giá và đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của bột cao khô tỏi đen gồm các chỉ tiêu:
+ Tính chất: Bột khô tơi, màu nâu hoặc vàng đậm, không có nấm mốc, mùi thơm, vị ngọt, dễ bị hút ẩm khi để ngoài không khí.
+ Độ ẩm: Không quá 5,0%.
+ Độ mịn: Lượng bột qua rây số 355 không được dưới 95,0%.
+ Kim loại nặng: Không quá 10 ppm.
+ Định tính: Phải có phép thử định tính của tỏi đen.
+ Định lượng: Hàm lượng S- Allyl- L- Cystein (C6H11SN) không nhỏ hơn 350 µg/g tính theo chế phẩm khô kiệt.
+ Độ nhiễm khuẩn: Tổng số vi sinh vật hiếu khí không quá 104 CFU/g; tổng số nấm không quá 102 CFU/g; Không quá 102 CFU vi khuẩn Gram âm dung nạp mật trong 1 g. Không có Salmonella trong 10 g. Không có Escherichia coli, Staphylococcus aureus trong 1 g.

1.2.3. Quy trình chiết xuất, bào chế cao định chuẩn trạch tả
- Đã xây dựng được quy trình điều chế cao lỏng Trạch tả 1:1 quy mô 5 kg/ 1 mẻ bằng phương pháp chiết siêu âm với các thông số là: dung môi EtOH 90%, chiết 2 lần, tỉ lệ dung môi/dược liệu 5/1, thời gian 60 phút/lần, nhiệt độ chiết 600C.
- Đã xây dựng điều kiện điều chế bột cao khô trạch tả: dịch chiết được cô về cao lỏng có hàm ẩm khoảng 25 %, tá dược phối hợp là tinh bột, tỷ lệ phối hợp là 20 % so với lượng chất rắn có trong cao, sấy khô ở nhiệt độ sấy 900C trong 13 giờ.
- Đã thẩm định đánh giá độ ổn định của quy trình trên 3 mẻ 5kg dược liệu/mẻ
- Đã tiến hành đánh giá và đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của bột cao khô trạch tả gồm các chỉ tiêu:
+ Tính chất: Bột khô tơi, màu vàng nâu, không có nấm mốc, mùi thơm, dễ bị hút ẩm khi để ngoài không khí.
+ Độ ẩm: Không quá 5,0%.
+ Độ mịn: Lượng bột qua rây số 355 không được dưới 95,0%.
+ Kim loại nặng: Không quá 10 ppm.
+ Định tính: Phải có phép thử định tính của trạch tả.
+ Định lượng: Hàm lượng alisol A không nhỏ hơn 2,0 mg/g tính theo chế phẩm đã làm khô.
+ Độ nhiễm khuẩn: Tổng số vi sinh vật hiếu khí không quá 104 CFU/g; tổng số nấm không quá 102 CFU/g; Không quá 102 CFU vi khuẩn Gram âm dung nạp mật trong 1 g. Không có Salmonella trong 10 g. Không có Escherichia coli, Staphylococcus aureus trong 1 g.

1.2.4. Quy trình chiết xuất bào chế cao định chuẩn giảo cổ lam
- Đã xây dựng được quy trình điều chế cao lỏng giảo cổ lam 1:1 bằng phương pháp chiết siêu âm với các thông số là: dung môi EtOH 80%, chiết 1 lần, tỉ lệ dung môi/dược liệu 20/1, thời gian 60 phút.
- Đã xây dựng được quy trình điều chế cao lỏng giảo cổ lam 1:1 quy mô 5 kg/1 mẻ để nghiên cứu bào chế bột cao khô.
- Đã xây dựng điều kiện điều chế bột cao khô giảo cổ lam:  dịch chiết được cô về cao lỏng có hàm ẩm khoảng 25 %, tá dược phối hợp là tinh bột, tỷ lệ phối hợp là 20 % so với lượng chất rắn có trong cao, sấy khô ở nhiệt độ sấy 900C trong 13 giờ.
- Đã thẩm định đánh giá độ ổn định của quy trình trên 3 mẻ 5kg dược liệu/mẻ
- Đã tiến hành đánh giá và đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của bột cao khô giảo cổ lam gồm các chỉ tiêu:
+ Tính chất: Bột cao khô giảo cổ lam có dạng bột khô tơi, màu vàng nâu, không có nấm mốc, mùi thơm đặc trưng của dược liệu, dễ hút ẩm ngoài không khí. Chế phẩm đồng nhất, không có màu lốm đốm.
+ Độ ẩm: Không quá 5,0%.
+ Độ mịn: Lượng bột qua rây số 355 không được dưới 90,0%.
+ Kim loại nặng: Không quá 10 ppm.
+ Định tính: Phải có phép thử định tính của giảo cổ lam.
+ Định lượng: Hàm lượng Ginsenoside Rb1 không nhỏ hơn 1,0 mg/g tính theo chế phẩm đã làm khô.
+ Độ nhiễm khuẩn: Tổng số vi sinh vật hiếu khí không quá 104 CFU/g; tổng số nấm không quá 102 CFU/g; Không quá 102 CFU vi khuẩn Gram âm dung nạp mật trong 1 g. Không có Salmonella trong 10 g. Không có Escherichia coli, Staphylococcus aureus trong 1 g.

2. Đã bào chế được viên nang cứng từ các cao định chuẩn tỏi đen, bụp giấm, trạch tả và giảo cổ lam
2.1. Đã khảo sát các tỷ lệ phối hợp các cao định chuẩn: dựa trên tác dụng ức chế enzym cholesterol esterase và tác dụng ức chế enzym HMG- CoA reductase tìm ra công thức phối hợp tối ưu là bột cao khô tỏi đen: bột cao khô giảo cổ lam: bột cao khô trạch tả: bột cao khô bụ giấm = 120:100:90:90.
2.2. Đã xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang từ các cao định chuẩn
- Đã xây dựng được công thức bào chế viên nang cứng từ các bột cao khô giảo cổ lam, tỏi đen,bụp giấm, trạch tả như sau:

Bột cao khô tỏi đen    120
Bột cao khô giảo cổ lam    100
Bột cao khô trạch tả    90
Bột cao khô bụp giấm    90
Tinh bột ngô    40 mg
Natri starchglycolat    40 mg
Magnesi stearat    14 mg
Aerosil    6 mg

- Đã xây dựng quy trình bào chế viên nang 10.000 viên/mẻ, thẩm định qua 3 lô sản xuất liên tiếp đạt các chỉ tiêu chấp nhận theo như TCCS của viên nang.  

2.3. Đã xây dựng và thẩm định tiêu chuẩn cơ sở của viên nang trên các chỉ tiêu:
Hình thức: Viên nang cứng có chứa bột thuốc khô tơi, màu vàng nâu, đồng nhất. Mùi thơm đặc trưng, vị đắng và hơi ngọt.
Độ rã: Không quá 30 phút.
Độ đồng đều khối lượng: Khối lượng trung bình thuốc trong nang ± 7,5%.
Định tính: Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của dược liệu dược liệu tỏi đen, bụp giẩm, trạch tả và giảo cổ lam
Định lượng: Hàm lượng S- Allyl- L- Cystein, acid protocatechuic và GRb1 trong một viên nang không được nhỏ hơn 0,5 mg; hàm lượng Alisol A trong một viên nang không được nhỏ hơn 0,1 mg.
Giới hạn nhiễm khuẩn: Đạt mức 4 .

2.4. Đã đánh giá độ ổn định của viên nang: Viên nang tỏi đen, bụp giấm, trạch tả, giảo cổ lam là ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc tới 6 tháng và ổn định ở điều kiện thực tới 12 tháng. Dựa vào phương trình Van’t Hoff tính toán dự đoán tuổi thọ của viên nang trên 36 tháng.

3. Đã đánh giá được độc tính, tác dụng dự phòng và điều trị xơ vữa động mạch của viên nang trên thực nghiệm
3.1. Đã đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang
3.1.1 Độc tính cấp: Chưa tìm thấy LD50 của viên nang theo đường uống trên chuột nhắt trắng. Với mức liều cao nhất có thể cho chuột uống là 12000 mg/kg thể trọng, mà không gây chết chuột nào, không có biểu hiện nào của độc tính cấp.
3.1.2. Độc tính bán trường diễn: Trên các lô chuột cống trắng cho uống viên nang từ tỏi đen, bụp giấm, trạch tả và giảo cổ lam liều 336 mg/kg/ngày (tương đương liều điều trị đã quy đổi từ liều trên người sang liều trên chuột cống trắng), và liều 1680 mg/kg/24h, liên tục trong 12 tuần, cho thấy:
- Tình trạng chung gồm hoạt động, ăn uống, tình trạng lông, da, niêm mạc, chất tiết của chuột bình thường.
- Không gây ảnh hưởng đến sự phát triển cân nặng của chuột.
- Không làm thay đổi các chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, nồng độ huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu).
- Không làm thay đổi các chỉ tiêu sinh hóa máu bao gồm hoạt độ các enzym AST, ALT, Bilirubin toàn phần, Albumin, Creatinin và Cholesterol toàn phần.
- Không gây tổn thương mô bệnh học gan, lách, thận.
Như vậy viên nang từ tỏi đen, bụp giấm, trạch tả và giảo cổ lam an toàn ở các mức liều dùng và thời gian sử dụng trong nghiên cứu đánh giá độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng.

3.2. Đã đánh giá được tác dụng dược lý của viên nang trên động vật thực nghiệm:
3.2.1. Trên mô hình gây rối loạn lipid máu theo cơ chế ngoại sinh ở chuột cống trắng, viên nang liều 336 mg/kg/ngày và liều 672 mg/kg/ngày có tác dụng tốt trong điều trị rối loạn lipid máu, tương đương với Atorvastatin liều 10mg/kg cân nặng: Làm giảm các chỉ số xét nghiệm lipid trong máu, gồm: hàm lượng TG, cholesterol toàn phần, LDL-Cholesterol, VLDL-Cholesterol, chỉ số vữa xơ mạch (chỉ số Atherogenic index – A.I). Làm tăng HDL-Cholesterol trong máu.

3.2.2. Trên mô hình gây rối loạn lipid máu theo cơ chế nội sinh ở chuột nhắt trắng, viên nang liều 576 mg/kg/ngày và 1152 mg/kg/ngày có tác dụng tốt trong điều trị rối loạn lipid máu, tương đương với Atorvastatin liều 15mg/kg cân nặng: Làm giảm các chỉ số xét nghiệm lipid trong máu, gồm: hàm lượng TG, cholesterol toàn phần, non - HDL-Cholesterol, chỉ số vữa xơ mạch (chỉ số Atherogenic index – A.I). Làm tăng HDL-Cholesterol trong máu.

3.2.3. Trên mô hình gây vữa xơ mạch bằng chế độ ăn nhiều mỡ cháy ở chuột cống trắng, viên nang liều 336 mg/kg/ngày và liều 672 mg/kg cho uống cùng với quá trình cho ăn béo gây vữa xơ trong thời gian 8 tuần, có tác dụng tốt trong dự phòng vữa xơ mạch, tương đương với Atorvastatin liều 10mg/kg cân nặng:
- Làm giảm các chỉ số xét nghiệm lipid trong máu, gồm: hàm lượng TG, cholesterol toàn phần, LDL-Cholesterol, chỉ số vữa xơ mạch (chỉ số Atherogenic index – A.I). Làm tăng HDL-Cholesterol trong máu. Làm giảm tình trạng nhiễm mỡ gan.
- Làm giảm hình ảnh tổn thương vữa xơ mạch động mạch chủ bụng chuột nghiên cứu. Hình ảnh vi thể nhuộm HE động mạch chủ bụng của các lô dùng thuốc không khác biệt nhiều so với của lô chứng sinh lý.

3.2.4. Trên mô hình gây vữa xơ mạch bằng chế độ ăn nhiều mỡ cháy ở chuột cống trắng, viên nang liều 336 mg/kg/ngày và liều 672 mg/kg, cho uống trong 28 ngày bắt đầu thừ khi kết thúc 8 tuần ăn béo gây vữa xơ, có tác dụng tốt điều trị vữa xơ mạch, tương đương với thuốc tham chiếu Atorvastatin liều 10mg/kg cân nặng:
- Làm giảm các chỉ số xét nghiệm lipid trong máu, gồm: hàm lượng TG, cholesterol toàn phần, LDL-Cholesterol, VLDL-Cholesterol, chỉ số vữa xơ mạch (chỉ số Atherogenic index – A.I).
- Làm tăng HDL-Cholesterol trong máu.
- Làm giảm tình trạng nhiễm mỡ gan.
- Làm giảm hình ảnh tổn thương vữa xơ mạch động mạch chủ bụng chuột nghiên cứu. Hình ảnh vi thể nhuộm HE động mạch chủ bụng của các lô dùng thuốc không khác biệt nhiều so với của lô chứng sinh lý.